DGGE : PERMASALAHAN DAN SOLUSI (Troubleshooting)

Oleh : Maroloan Aruan, Keukeu Kaniawati dan Kustiati

DGGE/ Denaturing Gradient Gel Electrophoresis adalah metode yang paling baik digunakan saat ini untuk mempelajari struktur komunitas bakteri tanpa membutuhkan proses kultivasi, berdasarkan keanekaragaman gen pengkode untuk RNA ribosom, dimana pola denaturasi DNA pada suhu tinggi menjadi dasar dari metode ini. Dengan menggunakan DGGE, fragmen DNA hasil amplifikasi PCR dari campuran mikroba dapat dipisahkan berdasarkan spesies/ jenis untuk melihat diversitas/ keanekaragamannya.

Pada umumnya DGGE digunakan untuk mengetahui variasi yang terjadi pada DNA, sehingga teknik ini dapat digunakan untuk mendeterminasi biodiversitas sampel bakteri dari tanah, air, air bergaram atau udara, mendeterminasi biodiversitas populasi bakteri pada tubuh manusia, deteksi mutasi pada gen manusia, identifikasi DNA mitokondria untuk proses forensik, deteksi genotip pada hewan pertanian, melihat perbedaan pada genom strain virus, penafsiran silsilah dalam ilmu tumbuhan dan RAPD-DGGE untuk menemukan polimorfisme pada genom tumbuhan.

Suhu denaturasi (melting point) fragmen DNA dipengaruhi oleh perbandingan komponen basa GC dan AT. Semakin banyak jumlah GC pada sekuen DNA, semakin tinggi suhu yang diperlukan untuk mendenaturasinya. Amplifikasi pada PCR-DGGE menggunakan primer yang mengandung GC-clamp (GC rich sequence) yang berfungsi sebagai clamp saat elektroforesis (Muyzer dkk. 1993). Gradien konsentrasi denaturan sepanjang gel akrilamida berfungsi menaikkan suhu denaturasi saat elektroforesis. Oleh karena itu, amplikon hasil PCR-DGGE yang dielektroforesis pada gel bergradien denaturan akan terpisah berdasarkan urutan nukleotidanya. 

Prinsip kerja DGGE adalah untuk memisahkan suatu fragmen DNA yang memiliki ukuran yang sama berdasarkan perbedaan konten GC ketika mengalami denaturasi. DGGE membutuhkan suatu denaturan bahan kimia seperti urea dan formamide. Ketika suatu fragmen double stranded DNA bermigrasi di dalam gel dan mencapai daerah yang mengandung denturan, rantai DNA mulai mengalami denaturasi, pada titik ini migrasi dari fragmen DNA tersebut terhenti. Perbedaan sekuen GC diantara fragmen yang memiliki ukuran sama tersebut menyebabkan perbedaan karakteristik dari masing masing fragmen ketika terjadi denaturasi sehingga menyebabkan fragmen DNA yang memiliki ukuran yang sama dapat terpisah (Madigan, 2008). Selanjutnya hasil elektroforesis ini akan dipotong dan kemudian dilakukan sekuensing terhadap tiap-tiap pita yang ada pada gel elektroforesis. Kemudian akan dilakukan analisis dengan menggunakan software Bioinformatika (BLASTn, Bioedit dan Mega 6) terhadap hasil sekuensing tersebut.

Menurut Erolini (2004), hasil DGGE sangat dipengaruhi oleh banyak hal termasuk langkah-langkah yang ada dalam prosedur, yaitu pemilihan primer, gradien gel DGGE dan bahkan prosedur pewarnaan yang digunakan. Pasangan primer digunakan untuk mengamplifikasi daerah variabel pada gen 16S rRNA. Hasil elektroforesis dari produk PCR tersebut akan menghasilkan suatu pita pada ukuran yang sama, namun susunan DNA pada ukuran tersebut berasal bukan dari satu jenis mikroba melainkan berasal dari suatu komunitas mikroba sehingga sebelum dilakukan analisis sequencing diperlukan suatu teknik pemisahan salah satunya dengan teknik Denaturating Gel Gradient Electrophoresis (DGGE).

MENURUT PENGALAMAN PENELITI

1. MASALAH : Kesulitan untuk menentukan konsentrasi gel Akrilamid, denaturan, voltase dan waktu running DGGE.

Jurnal Hayes et all (1999, Improvements in gel composition and electrophoretic conditions for broad-range mutation analysis by denaturing gradient gel electrophoresis) dapat menjadi bahan pertimbangan untuk menentukan konsentrasi gel Akrilamid, denaturan, voltase dan waktu running DGGE.

2. MASALAH : Kesulitan dalam hal purifikasi pita DNA dari gel Akrilamid, menunda waktu purifikasi, sehingga DNA rusak.

Cara mudah untuk mempurifikasi DNA dari pita gel Akrilamid (tanpa KIT purifikasi) adalah : memotong pita gel DNA, mengahncurkan gel dalam tube, menambahkan buffer TE kemudian diinkubasi 65 derajat C selama 30 menit dalam waterbath, lalu inkubasi pada suhu -20 derajat C overnight. Perhatian!! Proses ini harus dilakukan SEGERA setelah proses staining (jangan menunggu besok) (proses staining terlampir) karena DNA pada gel mudah rusak karena bentuknya yang masih berbentuk single strand sebagian. Kemudian rePCR dalam dilakukan menggunakan sampel hasil inkubasi. Usahakan sisa gel akrilamid tidak terikut untuk rePCR.

3. Proses DGGE membutuhkan perhatian terhadap voltase, waktu dan mA yang digunakan pada sumber listrik yang digunakan. Nilai mA yang berubah ubah akan menyebabkan ketidakstabilan pada saat running DGGE sehingga membuat power supply menjadi error. Nilai mA yang berubah-ubah kemungkinan disebabkan : TAE sudah terlalu sering dipakai atau mesin DGGE dengan adaptor gel mengalami kelonggaran.

4. MASALAH : Gel tidak membeku pada saat pencampuran denaturan, kemungkinan besar yang rusak adalah APS. APS harus selalu fresh dan penyimpanan harus selalu rapat (APS bersifat higroskopik), bisa pada suhu ruang atau pada suhu 4 derajat C.

5. MASALAH : posisi pita DNA menjadi miring. Hal ini disebabkan oleh terjadinya kebocoran pada saat mencetak gel Akrilamid. Posisi yang bocor akan menyebabkan poisi denaturan pada gel akan turun sehingga menyebabkan kemiringan pada gel Akrilamid.

Info : maroloanaruan@students.itb.ac.id

Referensi :
Muyzer, G. 1999. DGGE/TGGE a method for identifying genes from natural ecosystems. Current Opinion in Microbiology. 2(3): 317-322.

Wood GS, Uluer AZ. 1999. Polymerase chain reaction/denaturing gradient gel electrophoresis (PCR/DGGE): sensitivity, band pattern analysis, and methodologic optimization. Am J Dermatopathol. 1999 Dec;21(6):547-51.


LAMPIRAN 1
Silver Staining untuk Gel DGGE