IDENTIFIKASI ANTISENSE KIR lncRNA YANG DIEKSPRESIKAN OLEH SEL PROGENITOR

Oleh : Wright et al, 2013
Review oleh : Maroloan Aruan – 21113023
---------------------------------------------------------------------
Ringkasan. Sel NK manusia mengekspresikan MHC kelas 1 yang merupakan reseptor permukaan sel yaitu, KIR (Killer Cell Imunoglobulin-like Receptor). Dari penelitian sebelumnya telah terbukti bahwa promotor distal yang berkonjugasi dengan promotor proksimal bidirectional (2 arah) yang berfungsi dalam untuk mengendalikan aktivasi selektif dari gen KIR. Kami melaporkan disini kehadiran dari sebuah promotor 2 intron pada beberapa gen KIR, menghasilkan transkrip antisense penyambung. Transkrib Long Noncoding RNA ini (lncRNA) mengandung antisense sekuen yang komplemen terhadap ekson KIR-coding 1 dan 2 seperti pada proksimal daerah promotor dari gen KIR. Promotor antisense ini mengandung sisi pengikatan Myeloid Zinc Finger 1 (MZF-1), sebuah faktor transkripsi yang ditemukan pada progenitor hematopoietic dan precursor Myeloid. lncRNA antisense KIR hanya bisa ditemukan pada sel progenitor atau sel lini pluripoten, yang menunjukan sebuah fungsi yang spesifik pada sel punca. Ekspresi berlebihan dari MZF-1 pada perkembangan sel NK yang mengarah pada penurunan ekspresi KIR yang konsisten dengan pengaturan untuk KIR antisense lncRNA pada pembungkaman ekspresi gen KIR pada awal perkembangan.

TINJAUAN PUSTAKA
Sel NK adalah komponen penting dari Sistem Imun Bawaan dengan kemampuan untuk mengeleminasi infeksi virus dan sel tumor tanpa harus memiliki kepekaan terlebih dahulu akan infeksi tersebut. Sel NK berjumlah 10% dari total limfosit di darah dan organ limfoid perifer. Sel NK mengandung banyak granula sitoplasma dan mempunyai penanda permukaan (surface marker) yang khas. Sel NK mempunyai berbagai reseptor untuk molekul sel pejamu (host cell), sebagian reseptor akan mengaktivasi sel NK dan sebagian yang lain menghambatnya. Reseptor pengaktivasi bertugas untuk mengenali molekul di permukaan sel pejamu yang terinfeksi virus, serta mengenali fagosit yangmengandung virus dan bakteri. Aktivitas Sitolitik dari Sel NK dimodulasi oleh kehadiran atau ketiadaan molekul MHC Kls.1 pada sel target. Sel NK menggunakan reseptor permukaan sel dari MHC kls.1 untuk mengevaluasi status sel target. Tipe utama dari reseptor kls.1 yang diekspresikan oleh sel NK manusia adalah keluarga sel pembunuh immunoglobulin-like receptor (KIR). Secara nyata, analog fungsional reseptor penghambat murine adalah anggota dari keluarga Lectin tipe-C (Ly49 Receptor Family). Penelitian sebelumnya mendemosntrasikan bhawa terdapat variasi ekspresi dari gen Ly49 dan KIR yang ditentukan oleh operasi pertukaran Stochastic pada promotor region. Batas kemampuan dari gen KIR dapat terekspresi secara berbeda yang dikendalikan oleh metilasi DNA pada promotor region proximal.
Data yang disajikan dalam penelitian ini mengungkapkan adanya transkrip antisense tambahan pada gen 2DL1/S1 dan 3DL1/S1. Overlap dari transkrip ini dengan proksimal antisense transkrip mengarah ke produksi sebelumnya dicirikan 28-basis Pirna dari RNA noncoding panjang ini (lncRNA), dan ekspresi ditegakkan dari antisense distal juga mengarah ke ekspresi KIR ditekan. Karakterisasi kami dari promotor dan transkrip menunjukkan aktivitas hanya dalam sel pluripoten, menunjukkan peran fungsional untuk transkrip antisense dalam membungkam awal lokus KIR.


HASIL PENELITIAN
a. Deteksi Transkrip KIR antisense distal
Percobaan dirancang untuk mendeterminasi sisi awal 5’ untuk transkrip KIRDL1 antisense proksimal yang dilakukan dengan RNA dari cel lini HEK293 sebagai kontrol non-NK. Untuk menentukan apakah antisense juga ditemukan pada Kls.3D dari KIR maka dirancang primer spesifik untuk gen KIR3DL1 yang juga digunakan untuk mengisolasi transkrip antisense dari gen KIRDL1/S1.
Dari Gambar 2 : (a).skema organisasi dari 50 region gen KIR ditampilkan. Kotak hitam mewakili elemen promotor, dan persegi panjang bernomor mewakili ekson. Garis mewakili transkrip KIR dengan orientasi mereka ditunjukkan oleh panah. Urutan ekson tambahan yang ditemukan di KIR2DL1 yang transkrip alternative. (b).urutan nukleotida daerah berisi KIR2DL1 distal antisense intron 2/exon 3 sambatan persimpangan dan ekson 1/intron 1 sambatan persimpangan KIR2DL1-the coding transkrip ditampilkan. Konsensus sambatan akseptor (antisense) dan donor sambatan (akal) urutan digarisbawahi dalam huruf tebal. Hasil dari penelitian ini adalah bahwa sisi awal transkripsional untuk antisense KIR2DL1 distal memiliki lokasi yang sama dengan intron yang kedua, 181 nukleotida downstream dari exon KIR-coding yang kedua (gambar 2a). Menariknya bahwa penerima splice untuk exon antisense final hanya 7 bp downstream untuk donor splice exon 1 dari transkrip sense KIR, menunjukkan bahwa sisi splice penentu sinyal atau splicing enhancer adalah berbagi.

b. Karakterisasi KIR elemen promotor 2 intron
Dalam rangka untuk mendapatkan informasi tentang ekspresi preferensial yang diamati antisense distal dari KIR pada populasi sel induk, maka akan diselidiki yang diduga promotor 2 intron pada daerah gen KIR2DL1 dan KIR3DL1. Dari gambar 2 : (a).panel kiri adalah representasi skematis dari KIR2DL1 intron 2 fragmen ditunjukkan dalam orientasi antisense. Posisi KIR2DL1 dan KIR3DL1 distal lokasi awal antisense transkripsi ditandai dengan garis vertical diberi label dengan tanda bintang. Panel kanan menunjukkan aktivitas luciferase dari pGL3 konstruksi yang mengandung fragmen digambarkan di sebelah kiri. Konstruksi yang transfected ke dalam sel HEK293 dan aktivitas luciferase relatif ditentukan 48 jam pasca-transfeksi. (b) Analisis KIR2DL1 aktivitas promotor distal (membangun 7 dalam) di berbagai jalur sel ditampilkan. Nilai rata-rata mewakili bar and error menunjukkan deviasi standar dari setidaknya tiga percobaan independen. Gambar 2a menjelaskan hasil transfeksi promotor KIR2DL1 konstruksi ke HEK293. Aktivitas promotor tertinggi terdeteksi pada fragmen yang berisi situs pengikatan pusat untuk faktor transkripsi myeloid seng jari 1 (MZF-1) yang diduga bersama-sama dengan C / EBP dan Situs MYC terletak hilir. Penambahan 50 urutan mengandung tambahan AML-1/MZF- gabungan diduga 1 atau elemen NF-kB/AML-1 mengakibatkan aktivitas menurun.

c. Analisis EMSA inti MZF-1 situs dalam ekstrak sel YT dan HEK293
Ekspresi berlebih MZF-1 menghasilkan pengurangan 75% dalam ekspresi KIR dibandingkan dengan sel kontrol EGFP atau sel GFP-negatif hadir dalam sistem kultur Efek ini konsisten dan secara statistic signifikan dalam semua donor diuji. RNA total adalah dipanen dari kontrol EGFP atau sel MZF-1-overexpressing dan digunakan untuk RT-PCR dengan set primer yang secara khusus memperkuat baik MZF-1 mRNA atau transkrip antisense distal. Seperti yang diharapkan, Tingkat MZF-1 mRNA meningkat dalam kultur transduced dengan virus MZF-1-mengekspresikan. Antisense Distal adalah terdeteksi dalam budaya MZF-1 yang mengandung tapi tidak terekspreasi pada kontrol populasi, seperti yang diamati sebelumnya.

KESIMPULAN
1.Ekspresi pemaksaan MZF-1 selama diferensiasi in vitro sel NK menghasilkan tingkat antisense distal yang terdeteksi dan menurunnya tingkat ekspresi KIR konsisten dengan aktivitas gen-silencing transkrip distal.
2.lncRNA antisense KIR hanya bisa ditemukan pada sel progenitor atau sel lini pluripoten, yang menunjukan sebuah fungsi yang spesifik pada sel punca.
3.Ekspresi berlebihan dari MZF-1 pada perkembangan sel NK yang mengarah pada penurunan ekspresi KIR yang konsisten dengan pengaturan untuk KIR antisense lncRNA pada pembungkaman ekspresi gen KIR pada awal perkembangan.
4.Antisense lncRNA KIR3DP1 Ini sangat terekspresikan dalam CD56-bright NK, tetapi tidak terdeteksi di dewasa NK sel. Mungkin transkrip antisense KIR3DP1 ini dihasilkan kemudian pada titik dalam perkembangan untuk memastikan bahwa pseudogene tersebut tetap dalam keadaan silent.

REFERENSI
Jurnal utama : Wright et al. 2013. Identification of a KIR antisense lncRNA expressed by progenitor cells. Lab of Experimental Immunology, SAIC-Frederick Inc. USA

Jurnal Pendukung : Held, Werner and Kunz, Be´ atrice. 1998. An allele-specific, stochastic gene expression process controls the expression of multiple Ly49 family genes and generates a diverse, MHCspecific NK cell receptor repertoire. Ludwig Institute for Cancer Research, University of Lausanne. Switzerland.

Referensi lain :
Radaev, Sergei and Sun, Peter D. 2002. Structure and Function of Natural Killer Cell Srface Receptor. National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Maryland.
Nababan et al. 2007. Peranan Endothelial Progenitor Cell dalam Neovaskularisasi. Stem Cell and Cancer Institute, Kalbe Pharmaceutical Company, Jakarta, Indonesia.