MERANCANG (DESAIN) PRIMER UNTUK PROSES PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah teknik untuk melipat gandakan DNA dalam biologi molekuler dengan tujuan untuk diidentifikasi, manipulasi atau untuk keperluan forensik, diagnosis virus penyakit dan sebagainya. Spesifisitas dan efisiensi PCR amat ditentukan oleh kualitas primer yang digunakan.
Desain primer yang baik sangat penting untuk keberhasilan reaksi PCR. Pertimbangan desain yang penting untuk amplifikasi DNA spesifik untuk produk PCR tinggi:
1. Panjang Primer :
Hal ini secara umum diterima bahwa panjang optimal primer PCR adalah 18-22 mer (basa).

2. Primer Melting Temperature:
Primer Melting Temperature (Tm) merupakan temperatur yang diperlukan oleh separoh primer dupleks mengalamai disosiasi/lepas ikatan. Primer dengan Tm berkisar antara 52-58 oC sangat ideal, sedangkan Tm diatas 65oC akan mengurangi efektifitas anelaing sehingga proses amplifikasi DNA kurang berjalan baik. Tm ini sangat ditentukan oleh jumlah basa GC (GC contains).
Tm primer dapat dihitung dengan formula:
A. Tm (oC) = ((G+C) x4) + ((A+T) x2))……….secara kasar (kurang akurat)
B. Tm(oC) = {ΔH/ ΔS + R ln(C)} - 273.15……..secara akurat

3.Primer annealing temperature :
Primer annealing temperature (Ta) merupakan suhu yang diperkirakan primer dapat berikatan dengan template (DNA) dengan stabil (DNA-DNA hybrid stability). Jika suhu aneling tinggi akan menyulitkan terjadinaya iktan primer dengan DNA template sehingga akan menghasilkan produk PCR yang rendah(kurang efisien). Namun jika Ta terlalu rendah akan menyebabkan terjasinya penempelan primer pada DNA templat yang tidak spesifik. Ta dapat dihitung dengan menggunakan formula di bawah ini:
Ta = 0.3 x Tm(primer) + 0.7 Tm (product) – 14.9
Tm(primer) = Tm primer
Tm(product) = Tm produk PCR

4. GC Content :
Jumlah Basa G dan C (GC content) di dalam primer yang ideal sekitar 40-60%.

5. GC Clamp :
Jumlah basa G dan C yang terdapat pada 5 basa terakhir (3’) disebut dengan GC clamp. GC clamp yang baik sekitar 3 basa G/C dan tidan melebihi 5 basa G/C. keberadaan G/C di ujung 3’ primer sangat membantu terjadinya stabilitas iktan antara primer dengan DNA templat yang diperlukan untuk inisiasi polymerase DNA (proses PCR).

6. Primer Secondary Structures :
Hairpins : terbentuknya struktur loop/hairpin pada primer sebaiknya dihindari, namun sangat sulit untuk memperoleh primer tanpa memiliki struktur hairpin. Hairpin pada ujung 3' dengan ΔG(energy yang dipelukan untuk memecah struktur hairpin) = -2 kcal/mol dan hairpin internal dengan ΔG = -3 kcal/mol masih dapat ditoleransi.

LANGKAH - LANGKAH MERANCANG PRIMER :

1. MEMAHAMI TUJUAN PCR SAAT MERANCANG PRIMER
Apa yang menjadi tujuan PCR? apakah untuk mengamplifikasi gen universal seperti gen 16S ribosomal RNA bakteri, mendeteksi keberadaan suatu virus penyakit tertentu, Walking primer untuk analisa DNA sequencing fragment yang panjang, atau untuk tujuan lainnya.

2. MENCARI SEKUEN REFERENSI AKAN TARGET SEKUEN YANG AKAN DIAMPLIFIKASI
Misalkan target amplifikasi adalah virus TMV, maka kita mengumpulkan data sekuen TMV sebagai referensi. Usahakan agar pencarian kita lebih spesifik dengan cara menentukan gen targetnya. Kita bisa mencari sekuen referensi dari database GenBank di situs NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/). Ketikkan “Tobacco Mosaic Virus” sebagai kata kunci pencarian.

3. MELAKUKAN ALIGNMENT
Alignment dilakukan pada beberapa sekuen referensi untuk mendapatkan region konsensus, sehingga primer PCR tetap dapat mengamplifikasi pada beberapa variasi genetik pada beberapa spesies yang berbeda.
Software yang digunakan ClustlX/W di situs www.clustal.org/

4. MEMILIH SOFTWARE YANG AKAN DIGUNAKAN UNTUK MERANCANG PRIMER
Beberapa situs untuk merancang primer :
a.Primer3Plus di situs http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/
b.PrimerBlast di situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/